时间: 2024-01-20 20:01:03 | 作者: 企业新闻
噬菌体文库是用于基因克隆的噬菌体载体，噬菌体展现文库是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白交融，展现在噬菌体外表并坚持特定的空间构象，运用特异性亲和作用以挑选特异性蛋白或多肽的一项新技能。
卡梅德生物在抗体范畴研讨多年，咱们构建的噬菌体展现技能服务涵盖了多种文库类型，包容羊驼/骆驼VHH抗体库，人源噬菌体文库，人源SscFV抗体库，人源Fab抗体文库，噬菌体肽库，预制肽文库等多种优质的抗体库，可依照每个客户的需求供给定制服务，并供给灵敏有用的挑选服务。
噬菌体展现文库技能是一种新式的生物技能，运用噬菌体展现技能取得的外源蛋白坚持独立的空间结构和生物活性，现在在新式疫苗的研发，酶抑制剂的挑选，医学确诊和医治，多肽药物的开发，抗原表位剖析，单抗挑选，蛋白相互作用的研讨等范畴得到了广泛的运用，并显现了杰出的运用远景。
（1）挑选容量大、可发酵大量生产、办法简略，现在咱们取得的噬菌体一级免疫文库的库容可达108-109，其序列丰度99%，保证直接挑选取得的抗体亲和力到达nM乃至pM等级。
（2）将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种挑选新技能。
（3）快速制备可溶抗原，结合公司现在存在的重组蛋白表达体系，可以在极短的时间内制备出高纯度、高生物学活性的可溶抗原蛋白，用以支撑噬菌体抗体的免疫及挑选作业。
M13单链丝状噬菌体展现体系是现在运用较广泛的文库展现体系，经过将蛋白、抗体或多肽与噬菌体pIII蛋白交融表达，使之参加噬菌体拼装，并展现在噬菌体外表，构成噬菌体展现文库，卡梅德生物运用M13丝状噬菌体壳蛋白pIII和PVIII展现技能，可以为客户构建不一样的物种的天然或许免疫的噬菌体抗体展现文库，经过抗体库技能制备多物种单克隆抗体，如人，鼠，兔，鸡，羊，鹅，猪，牛，马，驴，骆驼，羊驼，鲨鱼等物种来历的单克隆抗体，可依照每个客户的需求供给定制服务，而且库容量可达1011。
卡梅德生物为客户供给噬菌体文库构建服务，流程包含：总RNA提取，回转录获取cDNA，PCR扩增，载体与 PCR 产品酶切衔接，细菌文库构建，噬菌体文库构建，噬菌体文库效价检测。
将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，参加氯仿，离心后取上清参加异丙醇，离心保存沉积，参加75%乙醇后离心保存沉积，枯燥后参加DEPC水，孵育保证RNA溶解，将各管混合到一管中即为总RNA，取1μl总RNA进行电泳，取2μl用核酸浓度测量仪测浓度。
依照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备，将上一步得到的RNA一分为二回转录成cDNA，回转录引物别离用Oligo dTprimer及random 6-mers。
以 cDNA 为模板进行第一轮PCR反响，运用HS Ex Taq酶进行PCR扩增。PCR反响体系为：
将得到的PCR扩增产品进行1%琼脂糖凝胶电泳，找到意图条带进行上述条件PCR扩增，将一切PCR产区进行1%琼脂糖凝胶电泳，运用通用型DNA纯化收回试剂盒对切胶的胶条进行DNA收回。
以上一步PCR扩增并收回后的DNA片段作为模板再次扩增特定的抗体片段，PCR 反响体系为：
第二轮PCR产品经过酶切衔接到噬菌体质粒中，然后构建含有扩增片段的噬菌体质粒库。将衔接产品运用DNA纯化收回试剂盒按说明书收回，别离取2μl用核酸浓度测量仪检测收回产品的浓度。
取大肠杆菌感受态细胞，参加收回后的衔接产品，将混合后的感受态细胞和衔接产品转移到预冷好的电转杯中，运用电转仪预设的转化程序电击转化，电转后当即往电转杯中参加950μl SOC培育基，至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在含有氨苄抗性的琼脂糖培育板上过夜成长。将上一步过夜成长后的培育板上的细胞用2xYT培育基和涂布棒冲刷刮下，参加20%的甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为细菌文库。
将上一步刮下的菌体混匀后转移到100 mL预先参加抗生素的2x YT培育液中，37℃，250rpm培育直至适宜的OD600nm值。
依照辅佐噬菌体：细菌细胞数目为20:1的份额参加辅佐噬菌体后持续37℃培育30分钟,参加适宜终浓度抗生素，30℃过夜摇床培育。
将过夜培育的细菌4℃ 4000 rpm离心20分钟，将上清转移到新的离心管后参加1/4体积预冷的的PEG/NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃ 4000 rpm离心20分钟去除上清后参加PBS缓冲液溶解沉积。再次参加适宜体积预冷的PEG/NaCl后冰上孵育10分钟，4℃ 12000 xg离心10分钟后去除上清并将沉积溶解在PBS中得到噬菌体库，长时间-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。
将-80℃冰箱保存的菌株培育后，从单菌落板上挑取一个单菌落到 5ml 2×YT 培育基过夜培育。取制备好的噬菌体文库稀释12个梯度，每个梯度参加90μl 的宿主菌液培育，每个稀释管取5μl加到2×YT 固体培育基过夜培育，即可核算效价。回来搜狐，检查更加多